ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுத்தல்:
மூலக்கூற்று உயிரியலில் ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுத்தல் (RNA extraction) என்னும் நுட்பம் மூலம் அனைத்து வகையான ஆர்.என்.ஏ க்களும் பிரிக்கப்படுகின்றன. இம்முறையில் திரிசால் (Trizol) என்னும் வேதிப்பொருள் மூலம் ஆர்.என்.ஏ க்கள் பிரிக்கப்பட்டாலும், தற்போது தனியார் நிறுவனங்கள் வழங்கும் ஆயத்த பொருள்கள் (kit) மூலம் மிக எளிமையாகவும், சிறப்பாகவும் வெகுவான அடர்வோடு (more concentration) ஆர்.என்.ஏ க்களை பிரிக்கலாம். சிறிய அளவிலான ஆர்.என்.ஏ க்களை (எ.கா. சிறு ஆர். என். ஏ (siRNA), குறு ஆர்.என்.ஏ (miRNA), டி ஆர்.என்.ஏ (tRNA) ) திரிசால் மூலம் பிரிக்கும் போது, வீழ்படிவு (precipitation) என்ற நிலையில் மிகக் குளிரிலும் (-80 C), மிக நீண்ட நேரத்திலும் (இரவு கடந்து அல்லது 24 மணிநேரத்தில், over night or 24h) நிலை நிறுத்த வேண்டியுள்ளது. மாறாக, செய்தி ஆர்.என்.ஏ (mRNA)-க்களுக்கு மிகக் குளிரில் (-20C) குறைந்த நேரத்தில் (1 மணி நேரம், 1h) வீழ்படிவாக மாற்றலாம்.
தற்காலத்தில் ஒவ்வொரு ஆர்.என்.ஏ பகுத்தலுக்கும் தனித் தனியான ஆயத்த பொருள்களை தனியார் நிறுவனங்கள் கண்டுபிடித்து உள்ளன.
ஆர்.என்.ஏ பிரித்தலில் உள்ள நிலைகள் (திரிசால் முறை) தொகு
1. முதலில் ஆர்.என்.ஏ பிரிக்கப்படவேண்டிய திசுக்களை நீர்ம நைட்ரசன் (liquid Nitrogen) உதவியைக் கொண்டு உறை நிலைக்கு (freeze) கொண்டு செல்ல வேண்டும். பின் இவற்றை மிகக் குளிர்நிலையில்(-80C) சேமிக்கலாம். மிகக் குளிர்நிலையில் உள்ள திசுக்களை ஒரு சிறு குழாயில் திரிசால் இட்டு நன்றாக அரைக்க வேண்டும். நன்றாக உயிரணுக்களாக பிரிக்கப்பட்ட திசுக்களை பனிக்கட்டியில் (ice cubes) நிலை நிறுத்தப்படும்.
திரிசால் என்பது பல பொருள்கள் கலந்த கலவை என்பதால், அவை உயிரணுக்களை உடைக்கும் தன்மையும், அதே வேளையில் டி.என்.ஏ மற்றும் புரதங்களை தனியாக பிரிக்கும் வல்லமை கொண்டவை.
2. 30 நிமிடம் கழிந்து, இக்கரைசலில் CHCL3 - ஐசோமைல் ஆல்க்ககால் (Isoamayl Alcahol) (24:1) இட்டு மிகவிரைந்து சுழற்றும் போது, புரதம் மற்றும் டி.என்.ஏ க்கள் அடியிலும், ஆர்.என்.ஏ க்கள் மேலும் நிற்குமாறு பகுக்கப்படும். மேல் மட்டத்தில் உள்ள நீர்மம் எடுக்கப்பட்டு, எத்தில் அல்ககோல் அல்லது ஐசோபுரோப்பனால் இடப்பட்டு ஆர்.என்.ஏ க்கள் வீழ்படிவமாக ஆக்கப்படும்.
ஆர்.என்.ஏ க்களின் தூய்மையை ஆர்.என்.ஏ கூழ்ம மின்புல புரைநகர்ச்சி என்னும் நுட்பம் மூலம் அறியலாம்.
கவனத்தில் கொள்ள வேண்டிய கருத்துகள்: தொகு
ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கும் முறை மிகக் கடினமானது ஆகும். ஏனெனில் அனைத்து இடங்களில் காணப்படும் ஆர்.என்.ஏசு (RNAse) என்னும் நொதி ஆர்.என்.ஏ க்களை அழிக்கும் தன்மை கொண்டவை. இவை நம் கைகளிலும் நாம் பயன்படுத்தும் ஆய்வு குழாய்களில் மிக எளிதாகக் காணப்படும். ஆர்.என்.ஏசுக்களை (RNAse) அகற்றுவதற்கு, ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கும் முறையில் பயன்படுத்தும் அனைத்து பொருள்களையும் DEPC (டைஎத்தில் பைரோகார்பொனேட், Diethyl pyrocarbonate) என்னும் வேதிப்பொருள் மூலம் அலசப்பட அல்லது கழுவப்பட வேண்டும். DEPC புற்று நோயைத் தூண்டும் தன்மை கொண்டவை (புற்றுநோயூட்டி). மேலும் ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுத்தல் முறையில் மிகத் தூய்மையான கையுறைகளை (gloves)கையாள்வதோடு,நாம் மிகக் கவனமாக முறையில் செயல்பட வேண்டும்.
டிஇபிசி (DEPC) ஆர்.என்.ஏ க்களில் கார்பாக்சி மெத்திலேற்றம் (carboxy methylation) என்னும் நிகழ்வை கொண்டு வருவதால், டிஇபிசி (DEPC) கொண்டு அலசப்பட்ட பொருள்களை மிக உயர் வெப்ப நிலை கொண்டு தூய்மையாக்கப்பட வேண்டும்.