பாலிமரேசு தொடர் வினை

மூலக்கூற்று உயிரியலில் பாலிமரேசு தொடர் வினை (polymerase chain reaction, PCR) தொழில்நுட்பத்தைத் பயன்படுத்தி, மரபு நூலிழையின் (DNA) குறிப்பிட்ட ஒரு சிறு பகுதியை பல்லாயிரக்கணக்கில் பெருக்க முடியும்.

பொதுவாக இவ்வினை முக்கியமான படிப்படியான மூன்று நிலைகளை கொண்டுள்ளது:

இயல்பிழத்தல் அல்லது பிரித்தல் (denaturation)
ஆற்றிப் பதப்படுத்தல் அல்லது சேர்த்தல் (Anneling)
நீட்டித்தல் (extension/elongation)

இவை தவிர இம் மூன்று படிகளுக்கும் முன்னராக ஒரு ஆரம்ப படிநிலையும், மூன்று படிகளுக்கும் பின்னரான இறுதி நீட்டித்தல், குறுகியகால சேமிப்புக்கான படிநிலைகளும் கருத்தில் கொள்ளப்படும். இதில் ஆரம்பப் படிநிலை நிறைவேறியதும், அடுத்து வரும் மூன்று படிநிலைகளும் மீண்டும் மீண்டும் பல தடவைகள் சுழற்சி முறையில் நிகழும். அப்போது மரபு நூலிழையின் குறிப்பிட்ட ஒரு பகுதி மட்டும் மீண்டும் மீண்டும் நகலெடுக்கப்பட்டு அதிகளவில் பெறப்படும். பின்னர் இறுதி நீட்சியின் பின்னர் அவை தேவைக்கேற்ப 4-15°செ யில் குறுகிய காலத்திற்கு, பாலிமரேசு தொடர் வினை நிகழ்ந்த கருவியினுள்ளேயே சேமிக்கப்படும்.

செய்முறைப் பொருட்கள்

பாலிமரேசு தொடர்வினைக்கான வரைபடம். (1) 94–96 °செ இல் பிரிப்பு (2) ~65 °செ இல் சேர்ப்பு (3) 72 °செ இல் நீட்டிப்பு. மேலேயுள்ளப் படத்தில் நான்கு சுழற்சிகள் காட்டப்பட்டுள்ளன. நீலக் கோடுகள் டி.என்.ஏ வார்ப்புருவைக் குறிக்கிறது. இதனுடன் முன்தொடர்கள் (சிவப்பு அம்புகள்) சேர்ந்து டி. என். ஏ பாலிமரேசு நொதியால் (வெளிர்ப்பச்சை வட்டங்கள்) நீட்டிக்கப்பட்டு டி.என்.ஏ குறுந்தொடர்கள் (பச்சைக் கோடுகள்) பெறப்படுகிறது. இத்தொடர்கள், பாலிமரேசு தொடர் வினைகள் தொடர்ந்து நடக்கும்போது முன்தொடர்களாக உபயோகிக்கப்படுகின்றன.

இவ்வினை நிகழ்வதற்கு பல்வேறு கூறுகளும், வினைப்பொருள்களும் தேவைப்படுகின்றன^[1]. அவை கீழே பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன:

நகலாக்கம் செய்யப்பட்டு, அதிகளவில் பெறப்பட வேண்டிய பகுதியை உள்ளடக்கிய மரபு நூலிழையின் வார்ப்புரு (DNA template).
இலக்கு மரபு நூலிழைப் பகுதியின் இரு இழைகளின் 3' (3 prime) முடிவுகளிலும் உள்ள தொடரிகளுக்கான, குறைநிரப்பு (complementary) தொடரிகளைக் கொண்ட இரு முன்தொடர்கள் (primers).
டி. என். ஏ பாலிமரேசு நொதி (DNA polymerase). இது en:Taq Polimerase ஆகவோ, அல்லது வேறு பாலிமரேசு ஆகவோ இருக்கலாம். இவை பொதுவாக 70°செ வெப்பநிலையில் தொழிற்படும் தன்மை கொண்டனவாக இருக்கும்.
அடினின், தயமின், சைட்டோசின், குவானின் போன்ற தாங்கிகளைக் கொண்ட, மரபு நூலிழையின் கட்டமைப்பு உறுப்புக்களான டி.என்.டி.பி க்கள் (dNTPs, Deoxyribo nucleoside triphosphates).
Mg²⁺ இருவலு நேர் அயனியைக் கொண்ட மெக்னீசியம் குளோரைடு (MgCl2) அல்லது மெக்னீசியம் சல்ஃபேட்டு (MgSo4)- . இவை நொதிகளைப் பொறுத்து வேறுபடும்.
கார, காடித் தன்மையை நிலை நிறுத்துவதன் மூலம் தாக்கம் நிகழுமிடத்தில் சிறப்பான தொழிற்பாட்டுக்கான வேதிச் சூழ்நிலையை வழங்குவதுடன், பாலிமரேசு நொதியை நிலையாக வைத்திருக்கவும் உதவும் காரக்காடி நிலைநிறுத்திக் (buffer) கரைசல்.

செயல்முறை

மரபு நூலிழையில் உள்ள குறிப்பிட்ட ஒரு பகுதியைப் பெருக்குவதற்கு இந்தத் தொழினுட்பம் உதவுகின்றது. இலக்குப் பகுதியானது பொதுவாக 0.1-10 கிலோ தாங்கிச் சோடிகளைக் (kilo base pairs - kb) கொண்டதாக இருக்கும். ஆனாலும் ஒரு சில தாக்கங்கள் 40 கிலோ தாங்கிச் சோடிகள் வரை பெருக்கும் தன்மை கொண்டன.^[2] குறிப்பிட்ட பகுதியின் பெருக்கமானது வழங்கப்படும் பொருட்களின் அளவில் தங்கியிருக்கும். செயற்பாட்டிற்குத் தேவையான அடிப்படைப் பொருட்கள் ஒரு வரம்பிற்குள் இருப்பதனால், செயற்பாடும் ஒரு நிலைக்குப் பின்னர் நின்றுவிடும்^[3].

தாக்கம் நிகழும் கலவையின் கனவளவானது 20μL - 200μL வரை வேறுபடும்.^[4]. இந்தக் கலவையானது 0.2–0.5 மி.லீ கனவளவுள்ள சோதனைக்குழாயில் எடுக்கப்பட்டு, வெப்பச் சுழற்சிக் (thermo cycler) கருவியொன்றினுள் தாக்கம் நிகழ்வதற்காக வைக்கப்படும். இந்தக் கருவி சோதனைக் குழாய்களின் வெப்பத்தைக் கூட்டியும், குறைத்தும், ஒவ்வொரு படிநிலையிலும் தாக்கத்திற்குத் தேவையான வெப்பத்தை வழங்குகின்றது. மிக மெல்லிய சுவரைக் கொண்ட இந்தச் சோதனைக் குழாய்கள், மாறும் வெப்பத்தை இலகுவாகக் கலவைக்குக் கடத்துவதனால், கலவையில் நிகழ வேண்டிய வெப்ப மாற்றம் மிக விரைவாக நிகழ்ந்து, மிகவும் குறுகிய நேரத்தில் வெப்பச் சமநிலைக்கு வருவதற்கு உதவும். குழாய்களை மூடியிருக்கும் கருவியின் மூடி சூடாக வைத்திருக்கப்படுவதனால், மூடியில் ஒடுங்குதல் மூலம் கலவையின் நீர்மப் பொருட்கள் படிதல் தவிர்க்கப்படும்.

இந்த செயல்முறையின் முக்கிய படிநிலைகளான பிரித்தல், சேர்த்தல், நீட்டித்தல் ஆகிய மூன்றும், மீண்டும் மீண்டும், மாறி மாறி வரும் வெப்பநிலை மாற்றங்களை உள்ளடக்கிய பல சுழற்சிகளைக் கொண்ட செயல்முறையாகும். பொதுவாக 20-40 சுழற்சிகளை உள்ளடக்கியதாக இருக்கும். இந்தச் செயல்முறையில் பயன்படுத்தப்படும் வெவ்வேறு வெப்பநிலைகளும், அவை பயன்படுத்தப்படும் நேரமும் பல்வேறு காரணிகளில் தங்கியிருக்கும். அவையாவன: பயன்படுத்தப்படும் நொதியின் தன்மை, கலவையினுள் இரு வலு அயனிகளினதும், டி.என்.டி.பி க்களினதும் (dNTPs) செறிவு, முன்தொடரிகளின் உருகுநிலை (T_m)^[5]

ஆரம்பப் படிநிலை

முதலில் ஆரம்பப் படிநிலையொன்றில், உயர் வெப்பநிலையில் (>90°செ)சில நிமிடங்கள் (1-10 நிமிடங்கள்) வைத்திருக்கப்படும். பொதுவாக 94–96°செ க்கு வெப்பநிலை உயர்த்தப்படும். வெப்பநிலை மாற்றத்திற்கு மிகவும் அதிக தாங்குதன்மை கொண்டு நிலையாக இருக்கக்கூடிய டி. என். ஏ பாலிமரேசு நொதி பயன்படுத்தப்படுமாயின், வெப்பநிலை 98°செ வரைகூட உயர்த்தப்படும். இதன்மூலம் நொதியின் செயற்படுதிறன் தூண்டப்படும்.

பிரித்தல்

இதுவே சுழற்சி வெப்பமாற்றத்திற்கான முதல் படிநிலையாகும். மரபு நூலிழை (DNA) ஏணியொன்றைச் முறுக்கி வைப்பது போன்ற இரட்டைச் சுருள் (double helix) வடிவ அமைப்பாகும். இந்த பிரித்தல் நிகழ்வின் போது, கலவையானது 94–96°செ வெப்பநிலையில் கிட்டத்தட்ட 20-30 செக்கன்கள் பேணப்படும். அப்போது இரட்டைச்சுருளில் இருக்கும் இழைகளின் தாங்கிகளுக்கிடையில் இருக்கும் ஐதரசன் பிணைப்புக்கள் உடைக்கப்பட்டு, இழைகள் ஒவ்வொன்றும் தனித்தனியாகப் பிரிக்கப்பட்டு, இரு தனி இழைகளை உருவாக்கும். நகலாகப் பெருக்கிப் பெறப்பட வேண்டிய பகுதியிலுள்ள வேறுபட்ட தாங்கிகளின் (bases) விகிதத்தைப் பொறுத்து, இந்தப் படிநிலைக்கான வெப்பநிலையில் சிறிய வேறுபாடுகள் இருக்கும்.

சேர்த்தல்

இந்தப் படிநிலையில் வெப்பநிலையானது குறைக்கப்பட்டு, குளிராக்கப்படும். 50–65 °செ வெப்பநிலையில், கிட்டத்தட்ட 20–40 செக்கன்களுக்குக் கலவை பேணப்படும். இந்த வெப்பநிலையானது பொதுவாக முன்தொடரிகளின் உருகுநிலையை (T_m) விட 3-5°செ குறைவாக இருக்கும்.

இந்நிகழ்வில் பிரிக்கப்பட்ட மரபு நூலிழைகள் ஒவ்வொன்றின் முடிவுப் பகுதியில், அவற்றிற்கென உருவாக்கப்பட்ட முன்தொடர்கள் (primers) இணைந்து கொள்ளும். இந்த முன்தொடர்கள், குறிப்பிட்ட மரபு நூலிழையில் எந்தப் பகுதி அதிகளவில் பெறப்பட வேண்டுமோ அந்தப் பகுதியின் முடிவிலிருக்கும் நியூக்கிளியோட்டைட்டு தொடரியிலுள்ள (nucleotide sequence) தாங்கிகளுக்கான (bases) குறைநிரப்பு (complementary) தாங்கிகளைக் கொண்ட நியூக்கிளியோட்டைட்டு தொடரியைக் கொண்டதாக இருக்கும். இந்தத் தன்மையால் அவை மரபு நூலிழையில் இலகுவாக இணைந்து கொள்ள முடிகின்றது. இந்தத் தாக்கம் நிகழும் வெப்பநிலையானது முன்தொடரிகளின் தன்மையில் தங்கியிருக்கும். அதாவது முன்தொடரிகளிலுள்ள தாங்கிகளின் எண்ணிக்கை, வெவ்வேறு தாங்கிகளின் விகிதம் என்பவற்றில் தங்கியிருக்கும்.

நீட்டித்தல்

இந்நிகழ்வில் மரபு நூலிழை பல்கி நகலாக பெருக்கப்படும் (Amplification). வெப்பநிலை 75–80°செ அமைக்கலாம். டி. என். ஏ. பாலிமரேசு நொதி உயர் வெப்பநிலையில் (எரிமலையில்) வாழும் பாக்டீரியாவிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்படுவதால், இந்நொதியின் செயற்பாடுகளுக்கு உகந்த வெப்பநிலை 75–80°செ ஆகும்^[6]^[7], குறைவான வெப்பநிலையில் இத்தகு பாலிமரேசு தொடர்வினைகள் சிறப்பாக நிகழ்வதில்லை.

பயன்படுத்தப்படும் நொதியின் செயற்படுதிறன் எந்த வெப்பநிலையில் மிகச் சிறப்பாக இருக்குமோ, அந்த வெப்பநிலை இங்கே தெரிவு செய்யப்படும். en:Taq polymerase ஆயின் அதன் செயற்படுதிறன் 75–80°செ வெப்பநிலையில் சிறப்பாக இருக்கும்.^[6]^[7]. பொதுவாக 72°செ யே இந்த நொதிக்குப் பயன்படுத்தப்படும். நொதியானது, வார்ப்புரு மரபு நூலிழையின் 5' இலிருந்து 3' திசையில், வார்ப்புருவிலிருக்கும் தாங்கிகளுக்கு குறைநிரப்பு தாங்கிகளைக் கொண்ட புதிய டி.என்.டி.பிக்களை செர்த்துக் கொண்டே போவதனால், தனி மரபு நூலிழை ஒவ்வொன்றிற்கும் குறைநிரப்பு நூலிழைகளை நீட்டித்துக்கொண்டே செல்லும். இதற்கு எடுக்கும் நேரமானது பயன்படும் நொதியிலும். பெருப்பிக்கப்பட வேண்டிய மரபு நூலிழையின் நீளத்திலும் தங்கியிருக்கும். ஆரம்பத்தில் இருக்கும் ஒவ்வொரு டி.என்.ஏ. மூலக்கூறிலிருந்தும், முதலாவது சுழற்சியின் இந்தப் படிநிலையின் முடிவில் இரு டி.என்.ஏ மூலக்கூறுகள் உருவாகும்.

இந்தப் படிநிலை முடிந்ததும், மீண்டும் பிரித்தல் படிக்குப் போய், இதுவே சுழற்சியில் மீண்டும் வரும். இரண்டாவது தடவை இந்தப் படிநிலை முடியும்போது 4 டி.என்.ஏ பகுதிகள் கிடைக்கும். அடுத்த சுழற்சியில் 8, பின்னர் 8 இலிருந்து 16, பின்னர் 32 என்று பெருக்கமானது இரண்டின் அடுக்குகளாக (2ⁿ) அதிகரித்துச் செல்லும்.

டி.என்.ஏ. கூழ்ம மின்புல புரைநகர்ச்சியின்போது, டி.என்.ஏ மூலக்கூறுகள், எதீடியம் புரோமைட் (Ethidium bromide) என்னும் சாயத்தால் சாயமூட்டப்படும். இங்கே மூன்று வெவ்வேறு இழைய மாதிரிகளிலிருந்து, இரு சோடி முன்தொடரிகளைக் கொண்டு இலக்கு டி.என்.ஏ பகுதி பெருக்கப்பட்டுள்ளது. மாதிரி 1 இல் டி.என்.ஏ பெருக்கம் ஏற்படவில்லை. மாதிரி 2 இலும், 3 இலும் வெற்றிகரமாக டி.என்.ஏ பகுதி பெருக்கமடைந்துள்ளது. அத்துடன் நிச்சயமாகக் குறிப்பிட்ட பகுதியை உடைய, பெருக்கமடையக் கூடிய ஒரு மாதிரியும் (positive control), அனைத்தையும் ஒப்பிட்டு அறியக்கூடிய பல அறிந்த டி.என்.ஏ துண்டங்களைக் கொண்ட டி.என்.ஏ ஏணியும் (DNA ladder) பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது.

இறுதி நீட்டிப்பு

மேற்கூறிய பிரித்தல், சேர்த்தல், நீட்டித்தல் ஆகிய மூன்று படிகளும் 20-40 சுழற்சிகள் அளவில் நிகழ்ந்து முடிந்த பின்னர், 5-15 நிமிடங்களுக்கு 70–74 °செ யில் கலவையானது வைத்திருக்கப்படும். இது, தனியாக எஞ்சி நிற்கும் மரபு நூலிழைகள் அனைத்திலும் நீட்டித்தல் செயல்முறை நிறவுபெற உதவும்.

இறுதி சேமிப்பு

தாக்க நிகழ்வுகள் அனைத்தும் முடிவடைந்ததும், குறுகிய காலத்திற்கு கருவியினுள்ளேயே சேமிப்பதற்காக, 4–15°செ யில் கலவை வைத்திருக்கப்படும்.

தாக்கத்தின் முடிவில் பெறப்பட்ட கலவையில் நாம் எதிர்பார்த்த டி.என்.ஏ பகுதி பெருக்கமடந்துள்ளதா என்பதை அறிய டி.என்.ஏ. கூழ்ம மின்புல புரைநகர்ச்சித் தொழினுட்பம் பயன்படுத்தப்படும். இத் தொழில்நுட்பத்தில் டி.என்.ஏ துண்டங்கள், அவற்றின் அளவிற்கேற்ப கூழ்மத்தில் பிரிக்கப்படும். டி.என்.ஏ ஏணி (DNA ladder) எனப்படும், மூலக்கூற்று நிறை தெரிந்த ஒரு குறியீட்டையும் அதே கூழ்மத்தில் பயன்படுத்துவதன் மூலம், அதில் கிடைக்கும் துண்டங்களுடன் ஒப்பிட்டு, நமக்குத் தேவையான துண்டம் கிடைத்துள்ளதா என்பதனை உறுதிப்படுத்தலாம்.

பாலிமரேசு தொடர்வினை வகைகள்

தொகுப்பு (colony) பி.சி.ஆர்.
ஆர். டி. பி.சி.ஆர். (ஆர்.என்.எ வை நிரப்பு இரட்டை உட்கரு அமிலமாக (சி.டி.என்.எ) மாற்றும் நுட்பம்)
அளவாக்க பி.சி.ஆர் (quantification PCR) - இவ் நுட்பத்தால் மரபணு வெளிப்படுதலின் அளவுகளை காணலாம்.
எதிர்புரதப் பற்றுகை பி.சி.ஆர் (Immuno-captured PCR): இம்முறையில் எதிர்ப்பான்களைப் பயன்படுத்தி, டி.என்.எ களை பிடித்து, பல்கி பெருக்கி உபயோகப்படுத்தப்படுகிறது.
தலைகீழ் பி.சி.ஆர். இந் நுட்பம் வட்ட வடிவிலான டி.என்.எ களை பல்கி பெருக்க பயன்படுத்தப்படுகிறது. மேலும் இவ்வினையின் மூலம் முழு டி.என்.ஏ. தொடர்ச்சிகளைப் (sequences) பெறலாம்.

மேற்கோள்கள்

↑ Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. பன்னாட்டுத் தரப்புத்தக எண் 0-879-69576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction
↑ S Cheng, C Fockler, W M Barnes, and R Higuchi (1994 June 7). "Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. NCBI. pp. 91(12): 5695–5699. பார்க்கப்பட்ட நாள் 16 பெப்ரவரி 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= and |date= (help)CS1 maint: multiple names: authors list (link)
↑ Ana C. Carr and Sean D. Moore* (31 May 2012). "Robust Quantification of Polymerase Chain Reactions Using Global Fitting". PLoS One. NCBI. pp. 7(5). பார்க்கப்பட்ட நாள் 16 பெப்ரவரி 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= (help)
↑ "PCR Optimization Student Guide, Fall 2012" (PDF). BABEC,. Applied Biosystems. Archived from the original (PDF) on 2013-07-17. பார்க்கப்பட்ட நாள் 17 பெப்ரவரி 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= (help)CS1 maint: extra punctuation (link)
↑ Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). "Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro". Nucl Acids Res 18 (21): 6409–6412. doi:10.1093/nar/18.21.6409. பப்மெட்:2243783.
↑ ^6.0 ^6.1 Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bacteriol 127 (3): 1550–1557. பப்மெட்:8432.
↑ ^7.0 ^7.1 Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.". PCR Methods Appl. 2 (4): 275-87. பப்மெட்:8324500.

[molecular_cloning-1] Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. பன்னாட்டுத் தரப்புத்தக எண் 0-879-69576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction

[2] S Cheng, C Fockler, W M Barnes, and R Higuchi (1994 June 7). "Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. NCBI. pp. 91(12): 5695–5699. பார்க்கப்பட்ட நாள் 16 பெப்ரவரி 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= and |date= (help)CS1 maint: multiple names: authors list (link)

[3] Ana C. Carr and Sean D. Moore* (31 May 2012). "Robust Quantification of Polymerase Chain Reactions Using Global Fitting". PLoS One. NCBI. pp. 7(5). பார்க்கப்பட்ட நாள் 16 பெப்ரவரி 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= (help)

[BABEC-4] "PCR Optimization Student Guide, Fall 2012" (PDF). BABEC,. Applied Biosystems. Archived from the original (PDF) on 2013-07-17. பார்க்கப்பட்ட நாள் 17 பெப்ரவரி 2014. {{cite web}}: Check date values in: |accessdate= (help)CS1 maint: extra punctuation (link)

[5] Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). "Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro". Nucl Acids Res 18 (21): 6409–6412. doi:10.1093/nar/18.21.6409. பப்மெட்:2243783.

[Chien_et_al.-6] 6.0 ^6.1 Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bacteriol 127 (3): 1550–1557. பப்மெட்:8432.

[Lawyer_et_al.-7] 7.0 ^7.1 Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.". PCR Methods Appl. 2 (4): 275-87. பப்மெட்:8324500.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]